細胞學研究雖然不能等于在體實驗，也不代表人體試驗。但具有更直觀更震撼的現象證據。2007年日本學者也是先在細胞研究發現氫氣的神奇不可思議作用，才進一步進行動物疾病模型和后來的人體試驗。當然氫氣細胞研究存在諸多困難，最突出的問題就是氫氣容易從培養體系釋放的問題。這導致劑量控制存在難處。不過這不是關鍵問題，關鍵是氫氣的作用足夠強大。 作者Peter C. Dartsch單位：德國達奇科學有限公司，細胞生物學檢測系統研究所，上安格街1 號，郵編 D - 86911，德國阿默爾湖畔迪森 背景：氫氣尚未在傳統醫學中得到廣泛應用和認可。然而，最近的研究結果表明，氫具有多種藥理作用，對多種疾病都有積極影響，其中包括腎臟疾病。在本研究中，我們采用細胞生物學檢測方法，直接對比富氫水 與未經處理的同一種自來水，探究富氫水在細胞層面是否具有有益作用。 實驗：富氫水是由德國misterwaterGmbH公司的兩種不同設備，根據操作說明，以當地初始自來水為原料制備而成。在產生氫氣后，立即對制得的富氫水進行檢測。將未經制氫設備處理的同一種自來水作為對照。實驗使用了一種成熟的腎臟上皮細胞系（MDCK；馬-達二氏犬腎細胞）。針對每個測試參數，至少進行了三個獨立實驗。使用雙尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和檢驗對數據進行統計分析。 結果：與初始自來水相比，使用新鮮制備的富氫水對腎臟上皮細胞的細胞代謝具有統計學意義上的顯著促進作用（p≤0.01）。在體積分數 為20%（體積比，平均值±標準差）時，促進作用最為顯著，達到21.4±7.4%。即使濃度更高的富氫水，其促進作用也顯著增加，體積分數為30%時增加約16%，體積分數為40%時也有類似的顯著提升。與初始自來水相比，富氫水可使率提高31.5±4.7%（20%體積分數）和28.9±4.5%（40%體積分數）。在所有實驗中，這種方面的改善都具有統計學顯著性（p≤0.01）。在外源活性氧誘導的氧化應激實驗中，在所有測試的過氧化氫濃度 下，富氫水組的細胞活力均優于初始自來水組，并且在過氧化氫濃度為2mM和5mM時，差異具有顯著性（p≤0.01）。從形態學上也能明顯看出富氫水的這種保護作用。 結論：定期飲用由misterwaterGmbH公司設備制備的新鮮富氫水，能夠改善腎臟細胞的細胞代謝，在細胞受損時促進再生過程，并在氧化應激情況下為細胞提供更多保護。因此，富氫水可能對人類健康和生活態度也具有有益影響。    引言 氫氣尚未在傳統醫學中得到廣泛應用和認可。然而，近期研究結果表明，氫具有多種藥理作用，如抗氧化、或抗凋亡特性[1]。與此同時，越來越多的研究致力于探究氫氣在各種疾病治療中的應用。氫氣具有多項優勢：它能夠迅速穿透組織和細胞，且不干擾代謝氧化還原反應或活性氧（ROS），而活性氧在體內細胞信號傳導中起著重要作用[2]。因此，正如一項關于致突變性、遺傳毒性以及每日攝入高達每千克體重20毫升富氫水的亞慢性口服毒性研究所示，使用氫氣應無不良影響[3]。 攝入氫的方法有多種，例如吸入氫氣或飲用富氫水。水的優勢在于其制備和使用都非常簡便，并且在常溫常壓下，氫能夠溶解在水中，濃度可達1.6ppm。與最初的預期相反，研究發現飲用富氫水的效果與吸入氫氣類似[2]。 腎臟的主要功能是清除血液中的毒素和代謝廢物，并調節人體的鹽分和水平衡，這一過程通過排尿來實現。腎小管參與血液過濾以清除廢物，其內部襯有一層上皮細胞。氧化應激可對腎臟和腎臟上皮細胞造成永久性損傷，因此，氫的使用為預防和治療腎臟疾病提供了一種選擇[1,4-6]。 在本研究中，我們運用細胞生物學檢測方法，直接對比富氫水與未經處理的同一種當地初始自來水，旨在探究富氫水在細胞層面是否具有有益作用。鑒于用戶所描述的積極效果，本研究僅針對培養的腎臟上皮細胞展開調查。 材料與方法 富氫水的制備與使用：在測試期間，使用德國misterwaterGmbH公司（地址：D-85540 Haar OT Salmdorf）的兩種不同設備，按照操作說明，以當地自來水為原料制備富氫水。由于產生并溶解的氫氣存在時間極短，制備完成后立即對所得的富氫水進行檢測。同時，通過密封細胞培養皿，盡可能延長氫氣對細胞培養物的作用時間。作為對照，使用未經制氫設備處理的同一種初始自來水。為避免滲透壓誘導的細胞改變和細胞體積調節問題，初始水和富氫水添加到培養基或反應混合物中的最大體積分數為40%（體積比）。 腎臟上皮細胞：本研究使用馬-達二氏犬腎（MDCK）細胞的親代菌株[7]。這是一種哺乳動物腎臟上皮細胞系，于1958年從一只成年雌性犬的腎小管中分離得到[8]，目前在生物醫學研究中廣泛應用于多種細胞生物學研究，如蛋白質運輸、細胞極性和細胞間接觸等方面。該細胞系還可用于研究藥物進入細胞以及在細胞內的運輸過程[9]。科學文獻中超過10萬篇的相關出版明了該細胞系的重要性。 細胞以冷凍保存狀態購自Sigma-Aldrich/ECACC（德國代森霍芬），解凍后常規培養于杜氏改良伊格爾培養基中，培養基含有10%的生長混合物和0.5%的慶大霉素，在37°C、5%二氧化碳、95%空氣且濕度超過90%的氣體培養箱中培養。細胞常規每周傳代兩次，經過幾次傳代后用于實驗。實驗持續了近6個月的時間。 基礎細胞代謝：實驗時，將處于80%-90%匯合度的細胞，以每孔50,000個細胞的密度接種于96孔培養板（每孔200微升培養基）中，孵育48小時，直至細胞完全貼壁、鋪展且細胞代謝恢復正常。向細胞中加入反應混合物，該混合物由含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水、作為能量來源的5mM葡萄糖、適當測試濃度的新鮮制備的富氫水或當地初始自來水，以及水溶性四唑染料WST-1（4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸鹽；德國代森霍芬Sigma-Aldrich公司）組成。 該染料的裂解及其導致的顏色變化與線粒體能量代謝和細胞活力直接相關[10-12]。使用酶標儀（BioTek Elx 808，配備Gen 5版本3.00軟件）在特定時間點（最長120分鐘）測量吸光度差值（?OD =450–690nm）記錄顏色變化，并使用Microsoft Excel進行分析。進行了四個獨立的測試系列（n=4），每個系列設兩個重復孔。 ：在該模型中，模擬了以細胞遷移和增殖來閉合損傷后缺損為特征的肉芽形成階段[13-16]。將細胞以每毫升100,000個細胞的密度接種到硅膠四孔培養插入物（德國格拉費爾芬ibidi公司）的各個小室中。插入物的各個小室由一個500微米厚的硅膠條分隔，外部硅膠框架厚700微米。由于特殊的粘附區域，硅膠插入物牢固地粘附在培養皿底部，形成一個明顯的無細胞區域（即“人工傷口”），細胞可通過遷移和增殖占據該區域。在細胞接種48小時后達到匯合度時，用鑷子取出硅膠插入物，使各小室之間的無細胞區域邊緣整齊。將體積分數為20%和40%的富氫水或初始當地自來水分別添加到不同培養皿的細胞中。讓腎臟上皮細胞遷移和增殖12小時。最后，用100%甲醇固定細胞培養物，用吉姆薩氏天青伊紅亞甲藍溶液（德國達姆施塔特默克公司）染色，然后風干。在顯微鏡下的6個不同點檢查細胞占據的區域，并使用奧地利格拉茨KML Vision公司的人工智能專業軟件（IKOSA AI軟件）進行計算。進行了三個獨立的實驗系列（n=3）。 外源誘導氧化應激后的細胞活力：本研究使用我們已建立的過氧化氫誘導的氧化應激（HP-IOS）測試系統。由3%的過氧化氫溶液（=880mM），通過用磷酸鹽緩沖鹽水進一步稀釋，制備出后續細胞培養測試濃度10倍濃縮的過氧化氫儲備溶液。將腎臟上皮細胞以每孔100,000個細胞的密度接種于24孔板中，使其貼壁、鋪展并穩定代謝48小時，直至達到約90%的匯合度。然后，將細胞與不同濃度的過氧化氫（0至2mM）以及體積分數為20%的富氫水或作為對照的初始當地自來水一起孵育24小時。最后，在加入XTT （2,3-雙-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺；瑞士阿爾施維爾Xenometrix公司）后，通過氧化還原顏色反應，使用酶標儀（BioTek ELx 808，配備Gen 5版本3.00軟件）在特定時間點（最長120分鐘）測量吸光度差值（?OD=450–690nm），以測定存活細胞的活性。進行了三個獨立的測試系列（n=3）。 統計分析：使用無參數的雙尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和檢驗進行統計分析。 結果與討論：在四個獨立實驗中，與反應混合物中的初始自來水相比，使用新鮮制備的富氫水對腎臟上皮細胞的細胞代謝具有統計學意義上的顯著促進作用（p≤0.01）（圖1）。在體積分數為20%（體積比，平均值±標準差）時，促進作用最為顯著，達到21.4±7.4%。即使更高濃度的富氫水，也顯示出顯著增加，體積分數為30%時增加15.6±6.3%，體積分數為40%時增加16.7±5.4%（平均值±標準差）。 對細胞培養物進行顯微鏡檢查以觀察再生過程，結果顯示，與初始自來水相比，暴露于新鮮制備的富氫水明顯促進了細胞對無細胞空間的占據（圖2）。與基礎細胞培養基（未展示）相比，測試的兩種體積分數的富氫水（20%和40%體積比）分別使再生過程提高了8.4±6.5%（20%體積比）和14.3±3.3%（40%體積比）。這意味著，即使因添加富氫水而稀釋了培養基中的營養成分，其效果仍優于培養基本身。此外，在所有實驗中，初始自來水均導致減少，因此，直接對比顯示，富氫水的效果總是比初始自來水好31.5±4.7%（20%體積比）和28.9±4.5%（40%體積比）。在所有實驗中，與初始當地自來水相比，富氫水對的改善具有統計學顯著性（p≤0.01）。在研究外源誘導的氧化應激對細胞活力的影響時，我們發現，與未添加活性氧培養的細胞相比，細胞活力隨著過氧化氫濃度的增加而降低。然而，與初始自來水相比，使用富氫水時的細胞活力總是更好（圖3）。在過氧化氫濃度為0.25至2mM時，富氫水組與初始自來水組相比，細胞活力提高了12%至17%，在過氧化氫濃度為5mM時，甚至提高了34.0±5.2%（平均值±標準差）。在過氧化氫濃度為2mM和5mM時，差異具有統計學顯著性（p≤0.01）。從形態學上也能明顯看出富氫水的這種保護作用（圖4）。 正如本研究中培養的腎臟上皮細胞實驗所示，與初始當地自來水相比，德國misterwater GmbH公司新鮮制備的富氫水證明了其有益效果。與未經處理的初始自來水直接對比，富氫水能夠顯著改善培養的腎臟上皮細胞的代謝和再生，以及在細胞層面滅活內源性自由基。這與其他科學家的研究結果一致，這些研究表明氫氣或富氫水在腎臟疾病的醫學應用和健康益處方面具有重要意義[1,5,6,17- 20]。因此，定期飲用由misterwater GmbH公司設備制備的新鮮富氫水，能夠改善腎臟細胞的細胞代謝，在細胞受損時促進再生過程，并在氧化應激情況下為細胞提供更多保護。所以，富氫水可能對人類健康和生活態度也具有有益影響。 圖1：在反應混合物中，不同體積分數下，與初始當地自來水相比，富氫水對腎臟上皮細胞基礎細胞代謝的相對促進作用的圖示。數據表示四個獨立實驗的平均值±標準差。(*) 表示在p ≤ 0.01水平上具有統計學顯著性（雙尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和檢驗）。 圖2：富氫水對培養的腎臟上皮細胞在12小時內的有益作用的顯微圖像。(A) 在培養基中使用體積分數為40%的富氫水，無細胞空間相對減少，因而情況更好。(B) 在培養基中使用體積分數為40%的初始當地自來水，由于減少，無細胞空間相對增加。使用配備10倍平消色差物鏡的奧林巴斯IX-50倒置顯微鏡和400萬像素分辨率的奧林巴斯E-10數碼相機，在明場照明下對固定和染色后的樣本進行觀察。 圖3：與未添加外源性活性氧的純培養基相比，富氫水（藍色柱形）和初始當地自來水（灰色柱形）的細胞保護效果結果圖示。將培養基的細胞活力設定為100%。在所有過氧化氫濃度下，富氫水始終具有更好的保護作用。數據表示三個獨立實驗的平均值±標準差。 圖4：富氫水對氧化應激后24小時內腎細胞活力的有益作用的顯微圖像展示。(A) 無氧化應激的對照培養組。(B) 在培養基中加入體積分數為20%的初始當地自來水，并用2 mM過氧化氫處理后，細胞變圓、脫離并漂浮，細胞活力下降。(C) 在培養基中加入體積分數為20%的富氫水，并用2 mM過氧化氫處理后，變圓和脫離的細胞數量較少，仍有細胞貼壁，且細胞活力更好。使用配備10倍平消色差物鏡的奧林巴斯IX-50倒置顯微鏡和400萬像素分辨率的奧林巴斯E-10數碼相機，在相差照明下進行觀察。
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